Identyfikacja nieuczęszczanych Bacillus z choroby Whipplea ad 5

Jako kolejny środek służący uniknięciu zanieczyszczenia bakteryjnego, wybraliśmy utrwalone w formalinie, zatopione w parafinie tkanki od pacjentów z pozajelitową chorobą Whipple a – pacjenci 2, 3, 4 i 5. Reakcje z określonymi starterami wytworzyły produkt o oczekiwanej wielkości z ekstraktów. stałych, wbudowanych węzłów chłonnych od pacjentów 2, 3 i 4 (ryc. 2B, ścieżki od 6 do 8, opaska na linii 7 jest słaba), a także z wyciągów z zamrożonej tkanki dwunastniczej od pacjentów i 5 (ryc. 2B, ścieżki 5 i 9). Wszystkie te reakcje dały takie same wyniki co najmniej dwa razy. Produkty PCR swoiste dla choroby Whipple a ze wszystkich pięciu pacjentów zostały zsekwencjonowane. Jeden klon od Pacjenta został zsekwencjonowany; jego sekwencja była identyczna z odpowiadającym 230-zasadowym regionem pierwotnej sekwencji 1321-zasadowej 16S rRNA opisanej powyżej. Jeden klon od Pacjenta 2 zsekwencjonowano; jego sekwencja różniła się od oryginalnej sekwencji w jednej pozycji. Sekwencja jednego z dwóch klonów z Pacjenta 3 różniła się od pierwotnej sekwencji w jednej pozycji, a sekwencja drugiego klonu różniła się w dwóch pozycjach. Produkty PCR od pacjentów 4 i 5 sekwencjonowano bezpośrednio, bez klonowania. Obie sekwencje były identyczne z pierwotną sekwencją (która dla Pacjenta 4 nie mogła być oceniona w jednej pozycji). Ten niezwykle niski stopień zmienności sekwencji wśród tych różnych próbek sugerował, że ta sama bakteria była obecna u wszystkich pięciu pacjentów z chorobą Whipple a.
Ocena starterów PCR swoistych dla choroby Whipple a Bacillus
Przetestowaliśmy specyficzność pary pW3FE-pW2RB, aby potwierdzić związek sekwencji 16R rRNA z chorobą Whipple a. Zastosowane ekstrakty pochodziły ze świeżo zamrożonych tkanek i utrwalonych formaliną, zatopionych w parafinie tkanek od pacjentów bez choroby Whipple a (Tabela 1). Konkretne startery nie powielały widocznego produktu z żadnym z tych ekstraktów przy licznych próbach, chociaż startery .-globiny wywołały pozytywne reakcje ze wszystkich z nich. Czasami reakcje z większą ilością ekstraktu tkankowego tworzyły słabe prążki o nieodpowiednio dużym rozmiarze. Niektóre z tych wyników przedstawiono na Figurze 2B (ścieżki 10 do 14). Jedną z negatywnych tkanek była próbka biopsji dwunastnicy z prawidłowymi cechami histologicznymi z Kontroli 2 (Tabela 1), która została uzyskana w tym samym zestawie endoskopowym co próbki od Pacjentów i 5.
Te primery testowano również z chromosomalnym DNA z ludzkiej limfoidalnej linii komórkowej K562, jak również z ekstraktami z liofilizowanych kultur Dermatophilus congolensis (ATCC 14637), Arthrobacter globiformis (ATCC 8010), Rhodococcus equi (szczep 90-568, prezent od Dr Dwight Hirsh, University of California, Davis) i Corynebacterium bovis (ATCC 7715). Wszystkie te próbki nie reagowały z pW3FE-pW2RB, ale reagowały ze starterami kontrolnymi (.-globina dla ludzkich tkanek lub p8FPL-p806R dla hodowli bakteryjnych, dane nie pokazane). Wybrano pierwsze trzy organizmy, ponieważ analiza filogenetyczna sekwencji 16S rRNA, którą wykryliśmy, sugerowała, że były one powiązane z Bacillus Whipple (patrz poniżej)
[hasła pokrewne: endometrioza w bliznie operacja, zabiegi fizykalne, maść ichtiolowa na trądzik ]