Identyfikacja nieuczęszczanych Bacillus z choroby Whipplea cd

Próbki z kontrolek i 2 oraz próbki biopsyjne od pacjentów i 5 uzyskano w tym samym zestawie endoskopowym. * Patrz dokument nr NAPS 04954 na 12 stron materiału dodatkowego. Zamówienie od NAPS c / o Microfiche Publications, PO Box 3513. Grand Central Station, Nowy Jork, NY 10163-3513. Zrezygnuj z góry (tylko w amerykańskich funduszach) 7,75 USD za kserokopie lub 4 USD za mikrofisze. Poza USA i Kanadą dodaj opłatę pocztową w wysokości 4,50 USD (1,75 USD za przesyłkę z mikrofiszami). Obowiązuje opłata za fakturę w wysokości 15 USD za wszystkie zamówienia zrealizowane przed dokonaniem płatności.
Ekstrakcja DNA
Dziesięć mikrometrowych fragmentów utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie tkanek ekstrahowano i trawiono w objętości 100 .l przez noc w 55 ° C i poza tym zgodnie z poprzednio opisanymi metodami. 8 W przybliżeniu 20 mg zamrożonej tkanki strawiono w tych samych warunkach. Około 10 mg każdej z liofilizowanych kultur bakteryjnych trawiono osobno w takich samych warunkach jak w zamrożonych tkankach. Tkanki z grupy kontrolnej zawsze przeplatały się z danymi od pacjentów i przetwarzano je równolegle.
Startery oligonukleotydowe
Tabela 2. Tabela 2. Startery oligonukleotydowe stosowane do amplifikacji sekwencji rRNA 16S. Startery oligonukleotydowe (Tabela 2) zsyntetyzowano w Laboratorium Rdzenia Centrum Choroby Trawiennej, Uniwersytecie Stanforda i Katedrze Mikrobiologii, Miami University, Oxford, Ohio.
Amplifikacja PCR
Jeden do 10 procent płynu supernatantu otrzymanego przez trawienie tkanki (ekstrakt) dodano do preparatu do reakcji amplifikacji, który również zawierał 200 nmoli każdego startera, 200 .mol każdego trifosforanu deoksyrybonukleozydu i 2 mmol chlorku magnezu na litr. Ekstrakty tkankowe badano najpierw pod kątem amplifikacji sekwencji genu ludzkiej .-globiny o 268 pz (parach zasad) ze starterami PC04 i GH20 (Perkin-Elmer, Norwalk, Connect.) 14 Jeśli ten produkt genu .-globiny nie mógłby być amplifikowane z ekstraktów z danej tkanki, nie przeprowadzono dalszych oznaczeń PCR tkanki. Po początkowych 4 minutach denaturacji w 95 ° C przeprowadzono 40 cykli amplifikacji w DNA Thermal Cycler 480 (Perkin-Elmer); każdy cykl obejmował jedną minutę denaturacji w 94 ° C, jedną minutę wyżarzania w 55 ° C i dwie minuty wydłużania w 72 ° C. Reakcje ze starterami pW3FE i pW2RB przeprowadzono przy każdym etapie wyżarzania w 60 ° C. Każdy zestaw reakcji amplifikacji z każdym zestawem starterów obejmował reakcje bez dodanego ekstraktu tkankowego i reakcje z ekstraktem z tkanek kontrolnych (Tabela 1). Produkty wykrywano za pomocą elektroforezy 10% objętości reakcyjnej w 1,5% żelu agarozowym zawierającym bromek etydyny.
Oznaczanie sekwencji DNA produktów amplifikowanych
Wszystkie wykrywanie i manipulowanie produktami PCR przeprowadzono w laboratorium innym niż wykorzystywane do ekstrakcji tkanek i amplifikacji PCR. Produkty z reakcji z ekstraktami tkankowymi od Pacjentów 1, 2 i 3 oraz Kontroli (Tabela 1) oczyszczono, sklonowano i zsekwencjonowano zgodnie z procedurą opisaną poprzednio.8 Produkty z reakcji z ekstraktami tkankowymi z Pacjentów 4 i 5 zsekwencjonowano bezpośrednio z komercyjnie dostępnym zestawem (Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit [Applied Biosystems, Foster City, CA)] i zautomatyzowanym systemem sekwencjonowania (Applied Biosystems Model 373A DNA Sequencing System15).
Analiza danych
Dopasowania sekwencji rRNA 16S, obliczanie odległości ewolucyjnej, wnioskowanie drzew filogenetycznych i analizę ładowania początkowego przeprowadzono jak opisano wcześniej.8, 16 17 18 19 20
Wyniki
Amplifikacja genu 16S rRNA
Tkanka od Pacjenta
Rysunek 2
[więcej w: dawca pamięci online cda, bobotic forte, olx hrubieszów ]