Identyfikacja nieuczęszczanych Bacillus z choroby Whipplea czesc 4

Fragmenty rDNA z amplifikacją PCR 16S z ekstraktów DNA tkankowego. Panel A pokazuje regiony bakteryjnego genu 16S rRNA, które odpowiadają czterem fragmentom (linie przerywane) zamplifikowane przez startery PCR (groty strzałek); przybliżona wielkość każdego fragmentu jest wyrażona powyżej w parach podstawowych. Odległość wzdłuż genu wyraża się w przybliżonych pozycjach nukleotydów (numeracja E. coli) .10 Panel B pokazuje wyniki elektroforezy w żelu agarozowym z fragmentów amplifikowanych za pomocą PCR. Para starterów użytych do amplifikacji jest wskazana powyżej każdej linii. Ścieżki 1,2,4 i 5 stanowią ekstrakt tkanki z Pacjenta 1; ścieżki 3 i 10, ekstrakt z Kontroli (Tabela 1); ścieżka 6, ekstrakt od Pacjenta 2; ścieżka 7, ekstrakt z Pacjenta 3; ścieżka 8, ekstrakt od Pacjenta 4; ścieżka 9, ekstrakt od Pacjenta 5; ścieżka 11, ekstrakt z kontroli 2; ścieżka 12, ekstrakt z kontroli 3; ścieżka 13, ekstrakt z węzła chłonnego śledzionowego węzła chłonnego z Kontroli 4; i ścieżkę 14, ekstrakt z Kontroli 5. Wielkość niektórych standardów DNA wyrażono w kilobazach.
Reakcje PCR z parą 16R rRNA szerokiego spektrum 16S rRNA p515FPL-p13B (Fig. 2A) odtwarzały w sposób odtwarzalny produkt DNA o oczekiwanej wielkości (około 904 bp, na podstawie sekwencji 16S rRNA Escherichia coli). z ekstraktem z tkanki dwunastniczej Pacjenta (ryc. 2B, linia 2). Reakcje bez dodanego ekstraktu tkankowego były negatywne (dane nie pokazane). Produkt DNA z tkanki Pacjenta sklonowano i zsekwencjonowano trzy klony. Te 838-pz sekwencje rRNA 16S pacjenta różniły się w czterech pozycjach i odpowiadały sekwencji bakterii niescharakteryzowanej.
Gdy ekstrakt tkanki żołądkowej z Kontroli (Tabela 1) był testowany w wielu reakcjach przebiegających równolegle, wszystkie reakcje były pozytywne (Fig. 2B, ścieżka 3). Częściowa sekwencja jednego klonu tej tkanki była 99,0 procent podobna do sekwencji 16S rRNA Helicobacter pylori – wynik zgodny z patologicznymi cechami tkanki.
Aby potwierdzić obecność pojedynczego dominującego genu rSNA 16S w ekstrakcie tkankowym z Pacjenta 1, zastosowano dwa inne zestawy bakteryjnych primerów PCR o szerokim zakresie działania. Reakcje amplifikacji z tym ekstraktem tkankowym i każdą z par p8FPL-p806R i p91E-p13B (Fig. 2A) dały produkty o oczekiwanej wielkości (Fig. 2B, ścieżki i 4). Para p91E-p13B od czasu do czasu generowała kilka mniejszych, niespecyficznych produktów. Wszystkie produkty PCR o pełnej wielkości zostały sklonowane, a dwa klony każdego z nich zostały zsekwencjonowane. Jedna sekwencja 439-bp z reakcji z p91E-p13B była identyczna z odpowiadającą częścią poprzednio uzyskanej sekwencji bakterii 838-bp; drugi klon różnił się w dwóch pozycjach. Dwie sekwencje 736-bp z reakcji z p8FPL-p806R były identyczne z regionem nakładania się 253-bp z sekwencją 838-bp otrzymaną z p515FPL-p13B (Fig. 2A) i różniły się od siebie w jednej pozycji. Te sekwencje wytworzone z ekstraktu tkanki pacjenta połączono, aby utworzyć sekwencję 1321-bp, reprezentującą około 90 procent genu 16S rRNA pojedynczej niescharakteryzowanej bakterii. Ta sekwencja została zdeponowana w bazie danych GenBank (numer dostępu, M87484).
Tkanka od pacjentów 2, 3, 4 i 5
Wcześniejsze badania sugerowały, że skażenie bakteryjne i uszkodzenie DNA utrudniają amplifikację PCR genów 16R rRNA swoistych dla patogenu z ekstraktów utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie tkanek.8 Aby uniknąć tych dwóch problemów z takimi tkankami zaprojektowaliśmy startery PCR pW3FE i pW2RB (Figa
[patrz też: olej lniany w kapsułkach, olx nowogard, acodin ulotka ]